1.概述
人們?cè)趯?shí)踐中早已總結(jié)出不同顏色的物質(zhì)具有不同的物理和化學(xué)性質(zhì)。根據(jù)物質(zhì)的這些特性可對(duì)它進(jìn)行有效的分析和判別。由于顏色本就惹人注意，根據(jù)物質(zhì)的顏色深淺程度來(lái)對(duì)物質(zhì)的含量進(jìn)行估計(jì)，可追溯到古代及中世紀(jì)。1852年，比爾（Beer）參考了 布給爾（Bouguer）1729年和朗伯（Lambert）在1760年所發(fā)表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時(shí)，顏色的強(qiáng)度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎(chǔ)，這就是的比爾朗伯定律。1854年，杜包斯克（Duboscq）和奈斯勒（Nessler）等人將此理論應(yīng)用于定量分析化學(xué)領(lǐng)域，并且設(shè)計(jì)了*臺(tái)比色計(jì)。到1918年，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局制成了*臺(tái)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。此后，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)經(jīng)不斷改進(jìn)，又出現(xiàn)自動(dòng)記錄、自動(dòng)打印、數(shù)字顯示、微機(jī)控制等各種類型的儀器，使光度法的靈敏度和準(zhǔn)確度也不斷提高，其應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大。
紫外可見(jiàn)分光光度法從問(wèn)世以來(lái)，在應(yīng)用方面有了很大的發(fā)展，尤其是在相關(guān)學(xué)科發(fā)展的基礎(chǔ)上，促使分光光度計(jì)儀器的不斷創(chuàng)新，功能更加齊全，使得光度法的應(yīng)用更拓寬了范圍。目前，分光光度法已為工農(nóng)業(yè)各個(gè)部門(mén)和科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域所廣泛采用，成為人們從事生產(chǎn)和科研的有力測(cè)試手段。我國(guó)在分析化學(xué)領(lǐng)域有著堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，在分光光度分析方法和儀器的制造方面上都已達(dá)到一定的水平［1］［2］
2.原理
物質(zhì)的吸收光譜本質(zhì)上就是物質(zhì)中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波長(zhǎng)的光能量，相應(yīng)地發(fā)生了分子振動(dòng)能級(jí)躍遷和電子能級(jí)躍遷的結(jié)果。由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會(huì)相同，因此，每種物質(zhì)就有其*的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長(zhǎng)處的吸光度的高低判別或測(cè) 定該物質(zhì)的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎(chǔ)。分光光度分析就是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜研究物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)間相互作用的有效手段。
紫外可見(jiàn)分光光度法的定量分析基礎(chǔ)是朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律。即物質(zhì)在一定濃度 的吸光度與它的吸收介質(zhì)的厚度呈正比，其數(shù)學(xué)表示式如下：
A=錬c
式中：A—吸光度（又稱光密度、消光值），
å—摩爾吸光系數(shù)（其物理意義為：當(dāng)吸光物質(zhì)濃度為1摩爾/升，吸收池厚為1厘米，以一定波長(zhǎng)原光通過(guò)時(shí)，所引起的吸光值A(chǔ)），b—吸收介質(zhì)的厚度（厘米），c—吸光物質(zhì)的 濃度（摩爾/升）。
物質(zhì)的顏色和它的電子結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系，當(dāng)輻射（光子）引起電子躍遷使分子（或離子）從基態(tài)上升到激發(fā)態(tài)時(shí)，分子（或離子）就會(huì)在可見(jiàn)區(qū)或紫外呈現(xiàn)吸光，顏色的發(fā)生或變化是和分子的正常電子結(jié)構(gòu)的變形的。當(dāng)分子中含有一個(gè)或更多的生色基因（即具有不飽和鍵的原子基團(tuán)），輻射就會(huì)引起分子中電子能量的改變。常見(jiàn)的生色團(tuán)有：
CO， -N=N-， -N=O，-C N，CS
如果兩個(gè)生色團(tuán)之間隔一個(gè)碳原子，則形成共軛基團(tuán)，會(huì)使吸收帶移向較長(zhǎng)的波長(zhǎng)處（即紅移），且吸收帶的強(qiáng)度顯著增加。當(dāng)分子中含有助色基團(tuán)（有未共用電子對(duì)的基團(tuán)）時(shí)，也會(huì) 產(chǎn)生紅移效應(yīng)。常見(jiàn)的助色基團(tuán)有：-OH -NH2， -SH， -Cl, -Br, -I
3.特點(diǎn)
分光光度法對(duì)于分析人員來(lái)說(shuō)，可以說(shuō)是zui有用的工具之一。幾乎每一個(gè)分析實(shí)驗(yàn)室都離不開(kāi)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。分光光度法的主要特點(diǎn)為：
（1）應(yīng)用廣泛
由于各種各樣的無(wú)機(jī)物和有機(jī)物在紫外可見(jiàn)區(qū)都有吸收，因此均可借此法加以測(cè)定。到目前為止，幾乎化學(xué)元素周期表上的所有元素（除少數(shù)放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法 。在上發(fā)表的有關(guān)分析的論文總數(shù)中，光度法約占28%，我國(guó)約占所發(fā)表論文總數(shù)的33% 。
（2）靈敏度高
由于新的顯色劑的大量合成，并在應(yīng)用研究方面取得了可喜的進(jìn)展，使得對(duì)元素測(cè)定的靈敏度有所推進(jìn)，特別是有關(guān)多元絡(luò)合物和各種表面活性劑的應(yīng)用研究，使許多元素的摩爾吸光系數(shù)由原來(lái)的幾萬(wàn)提高到數(shù)十萬(wàn)。
（3）選擇性好
目前已有些元素只要利用控制適當(dāng)?shù)娘@色條件就可直接進(jìn)行光度法測(cè)定，如鈷、鈾、鎳、銅、銀、鐵等元素的測(cè)定，已有比較滿意的方法了。
（4）準(zhǔn)確度高
對(duì)于一般的分光光度法，其濃度測(cè)量的相對(duì)誤差在1～3%范圍內(nèi)，如采用示差分光光度法進(jìn)行測(cè)量，則誤差可減少到0.X%。
（5） 適用濃度范圍廣
可從常量（1%～50%）（尤其使用示差法）到痕量（10-8～10-6%）（經(jīng)預(yù)富集后）。
（6） 分析成本低、操作簡(jiǎn)便、快速
由于分光光度法具有以上優(yōu)點(diǎn)，因此目前仍廣泛地應(yīng)用于化工、冶金、地質(zhì)、醫(yī)學(xué)、食品、制藥等部門(mén)及環(huán)境監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。單在水質(zhì)分析中的應(yīng)用就很廣，目前能有直接法和間接法測(cè)定的金屬和非金屬元素就有70多種。
4 應(yīng)用
4.1 檢定物質(zhì)
根據(jù)吸收光譜圖上的一些特征吸收，特別是zui大吸收波長(zhǎng)雖ax和摩爾吸收系數(shù)澹是檢定物質(zhì)的常用物理參數(shù)。這在藥物分析上就有著很廣泛的應(yīng)用。在國(guó)內(nèi)外的藥典中，已 將眾多的藥物紫外吸收光譜的zui大吸收波長(zhǎng)和吸收系數(shù)載入其中，為藥物分析提供了很好的手段。
4.2 與標(biāo)準(zhǔn)物及標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照
將分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品以相同濃度配制在同一溶劑中，在同一條件下分別測(cè)定紫外可見(jiàn)吸收光譜。若兩者是同一物質(zhì)，則兩者的光譜圖應(yīng)*一致。如果沒(méi)有標(biāo)樣，也可以和現(xiàn)成的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照進(jìn)行比較。 這種方法要求儀器準(zhǔn)確，精密度高，且測(cè)定條件要相同。
4.3 比較zui大吸收波長(zhǎng)吸收系數(shù)的一致性
由于紫外吸收光譜只含有2～3個(gè)較寬的吸收帶，而紫外光譜主要是分子內(nèi)的發(fā)色團(tuán)在紫外區(qū)產(chǎn)生的吸收，與分子和其它部分關(guān)系不大。具有相同發(fā)色團(tuán)的不同分子結(jié)構(gòu)，在較大分子中不影響發(fā)色團(tuán)的紫外吸收光譜，不同的分子結(jié)構(gòu)有可能有相同的紫外吸收光譜，但它們的吸收系數(shù)是有差別的。如果分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸收波長(zhǎng)相同，吸收系數(shù)也相同，則可認(rèn)為分析樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品為同一物質(zhì)。
例1 己二烯-1，5（CH2=CHCH2CH2=CH2）的zui大吸收波長(zhǎng)雖ax為178nm（摩爾吸收系數(shù)為26000），而己烯-1（CH2=CHCH2CH2CH2CH3）的zui大吸收波長(zhǎng)為雖ax 為177nm（摩爾吸收系數(shù)邐11800）。此兩個(gè)物質(zhì)有相同的發(fā)色團(tuán)，雖ax值基本相同，但值不同，二烯的逯當(dāng)鵲ハ┑拇?。震~得饔邢嗤牡舜瞬還查畹姆⑸?，其吸收波长皆?于單個(gè)發(fā)色團(tuán)的值，但逯翟蛩嫦嗤⑸攀康腦黽傭黽?。染J屑父齜⑸瘧舜斯查，則吸收長(zhǎng)向紅移動(dòng)。象丁二烯-1，3（CH2=CHCH=CH2）與己二烯-1，5（CH2=CHCH2 CH2CH=CH2）相比，同樣有兩個(gè)雙鍵，但丁二烯-1，3中為共軛體系，它的zui大吸收長(zhǎng)雖 ax為210nm，而摩爾吸收系數(shù)逯翟蠐爰憾-1，5基本一樣。
4.4 純度檢驗(yàn)
例2 紫外吸收光譜能測(cè)定化合物中含有微量的具有紫外吸收的雜質(zhì)。如果化合物的紫外可 見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有明顯的吸收峰，而它的雜質(zhì)在紫外區(qū)內(nèi)有較強(qiáng)的吸收峰，就可以檢測(cè)出化合物中的雜質(zhì)。
例3 檢測(cè)乙醇樣品含有的苯的雜質(zhì)。苯的zui大吸收波長(zhǎng)在256nm，而乙醇在此波長(zhǎng)處沒(méi)有 吸收。在紫外吸收光譜上就能很明顯地看出來(lái)。
如果化合物在紫外可見(jiàn)有吸收，可用吸收系數(shù)檢測(cè)其純度。
例4 菲的氯仿溶液在296 nm處有強(qiáng)吸收，邐12600，log 邐4.10，用某方法精制的菲在紫外上測(cè)出的1og 逯當(dāng)缺曜嫉姆埔10%，這說(shuō)明實(shí)際含量只有90%，其余的就很有可能是 雜質(zhì)了。
例5 還可以用差示法來(lái)檢測(cè)樣品的純度。取相同濃度的純品在同一溶劑中測(cè)定作空白對(duì)照 ，樣品與純品之間的差示光譜就是樣品中含有雜質(zhì)的光譜。
4.5 推測(cè)化合物的分子結(jié)構(gòu)
（1） 推測(cè)化合物的共軛體系和部分骨架
如果一個(gè)化合物在紫外區(qū)是透明的，沒(méi)有吸收峰（吸收系數(shù)澹10），則說(shuō)明不存在共軛體系 （指不存在多個(gè)相間雙鍵）。它可能是脂肪族碳?xì)浠衔?、胺、腈、醇等不含雙鍵或環(huán)狀結(jié)構(gòu) 的化合物。
如果在210-250nm有強(qiáng)吸收，則可能有兩個(gè)雙鍵共軛系統(tǒng)（如共軛二烯或?，?不飽和酮）。
如果在250-300nm有強(qiáng)吸收，則可能具有3-5個(gè)不飽和共軛系統(tǒng)。
如果在260-300nm有中強(qiáng)吸收（吸收系數(shù)=200-1000），則可能有苯環(huán)。
如果在250-300nm有弱吸收，則可能存在羰基基團(tuán)
（2） 區(qū)分化合物的構(gòu)型和構(gòu)象
例6 化合物二苯乙烯有順式和反式兩種構(gòu)型：
它們的zui大吸收波長(zhǎng)和吸收強(qiáng)度都不同，由于反式構(gòu)型沒(méi)有空間障礙，偶極矩大，而順式構(gòu)型有空間障礙，因此反式的吸收波長(zhǎng)和強(qiáng)度都比順式的來(lái)得大。為此就很容易區(qū)分順式和反式構(gòu)型了。
（3）互變異構(gòu)體的鑒別。
在有機(jī)化學(xué)中，會(huì)有異構(gòu)體的互變現(xiàn)象，通過(guò)紫外光譜也可鑒別。
例7 異丙基酮有兩種分異構(gòu)體：
CH3CCH3CHCOCH3
CH2CCH3CH2COCH3
（a） （b）
在紫外吸收光譜上，由于（a）的分子結(jié)構(gòu)中碳碳雙鍵和羰基處于共軛體系，故在235nm處有強(qiáng)吸收（=12000），而（b）的分子結(jié)構(gòu)中的碳碳雙鍵和羰基不存在共軛體系，故在220nm以上沒(méi) 有強(qiáng)吸收。
例8 乙酰乙酸乙酯有酮式和烯醇式兩種變異構(gòu)體：
CH3COCH2COO C2H5
（酮式）
CH3COH··CHCCH2 HO
（烯醇式）
烯醇式結(jié)構(gòu)中羰基和主鏈的雙鍵共軛，其雖an為245nm（邐18000），而酮式結(jié)構(gòu)中沒(méi)有共軛體系，故在210nm以上沒(méi)有強(qiáng)吸收帶。在極性溶劑（例如水）中，酮式結(jié)構(gòu)與溶劑分子因形 成氫鍵而被穩(wěn)定，故在極性溶劑中以酮式結(jié)構(gòu)為主（約占85%），而在非極性溶劑（例如正乙烷 ）中，烯醇式因生成分子內(nèi)氫而被穩(wěn)定，故在非極性溶劑中以烯醇式結(jié)構(gòu)為主，在正乙烷溶劑中烯醇式結(jié)構(gòu)約占96%。這種互變異構(gòu)的轉(zhuǎn)換情況在紫外光譜就很容易看出來(lái)。
4.6 氫鍵強(qiáng)度的測(cè)定
實(shí)驗(yàn)證明，不同的極性溶劑產(chǎn)生氫鍵的強(qiáng)度也不同，這可以利用紫外光譜來(lái)判斷化合物在不同溶劑中氫鍵強(qiáng)度，以確定選擇哪一種溶劑。
例9 在例6中提到的異丙基丙酮在溶劑環(huán)己烷（非極性溶劑）、乙醇、甲醇和水中的雖an分 別為335、320、312和300nm。假定這種雖an*由溶劑的氫鍵所引起，則可以利用下式計(jì)算每種溶劑中的氫鍵強(qiáng)度。對(duì)每種情況，紫外輻射每摩爾能量為
E=Nh=Nhc/ë
式中：N—阿佛加德羅常數(shù)，N=6.023×1023；
h—普朗克常數(shù)，h=6.62×10-34J·s；
c—光速c=3×1010cm/s
對(duì)于環(huán)已烷，雖ax=335nm=33510-7cm；
因此 ，紫外輻射能量N=（6.023×1023×6.62×10-34）/（335×10-7）=3. 57×105J/mol
同樣可求得乙醇、甲醇和水中的紫外輻射能量分別為3.74×105、3.83×105、3.98×1 05J/mol。將這些輻射能扣除在非極性溶劑中的輻射能后，便得到在這些極性溶劑中的氫鍵強(qiáng)度：
在乙醇中氫鍵強(qiáng)度為
3.74×105-3.57×105=1.7×104J/mol
在甲醇中3.83×105-3.57×105=2.6×104J/mol
在水中3.98×105-3.57×105=4.1×104J/mol
4.7 絡(luò)合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定
金屬離子常與有機(jī)物形成絡(luò)合物，多數(shù)絡(luò)合物在紫外可見(jiàn)區(qū)是有吸收的，我們可以利用分光光度法來(lái)研究其組成。當(dāng)金屬離子M和配位體L（在這兒往往是顯色劑）形成絡(luò)合物ML時(shí)，絡(luò)合 物反應(yīng)如下：
M+nR=MRn
當(dāng)達(dá)到絡(luò)合平衡時(shí)，其絡(luò)合物穩(wěn)定常數(shù)為：
K=CMRn/（CMCR）
若M與R不干擾MRn的吸收，且其分析濃度分別為CM、CR，那么固定金屬離子M的濃度，改變顯色劑R的濃 度，就可以得到一系列CM/CR值不同的溶液。在適宜的波長(zhǎng)條件下測(cè)量各溶液的吸光度，然后以吸光度A對(duì)CM/CR 作圖。當(dāng)加入的試劑R還沒(méi)有使M定量轉(zhuǎn)化為M Rn時(shí)，該曲線處于直線階段，當(dāng)加入的試劑R已使M定量轉(zhuǎn)化為MRn。并稍有了過(guò)量時(shí)，曲線便出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，加入的R繼續(xù)過(guò)量，曲線又是水平直線。那么轉(zhuǎn)折點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的摩爾比數(shù)即是絡(luò)合物的組成比。若絡(luò)合物比較穩(wěn)定，則轉(zhuǎn)折點(diǎn)明顯。若絡(luò)合物不穩(wěn)定，則轉(zhuǎn)折點(diǎn)不明顯，此時(shí)可用外推法求得兩條直線的交點(diǎn)，交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的CM/CR值即為絡(luò)合物MRn中的n值。
如果在兩種不同的金屬離子和配位體總濃度（總摩爾數(shù)）的條件下，在同一坐標(biāo)上分別作吸光度對(duì)兩種不同總摩爾數(shù)的溶液組成曲線，在曲線上找出吸光度相同的兩點(diǎn)，則在此兩點(diǎn)上對(duì)應(yīng)的絡(luò)合物濃度應(yīng)相同，為此便可通過(guò)計(jì)算出絡(luò)合物穩(wěn)定常數(shù)K。
4.8 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究
借助于分光光度法可以得出一些化學(xué)反應(yīng)速度常數(shù)，并從兩個(gè)或兩個(gè)以上溫度條件下得到的速度數(shù)據(jù)，得出反應(yīng)活化能。在丙酮的溴化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究中就是一個(gè)成功的例子。
例10 在有機(jī)化學(xué)中，丙酮的溴化反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜反應(yīng)，其反應(yīng)式為：
CH3COCH3 +Br2
CH3COCH2Br+Br-+H+
該反應(yīng)由氫離子催化，則反應(yīng)速度為：
K=k［CH3COCH3］p［Br2］q［H+］r
式中：k—反應(yīng)速度常數(shù)
物質(zhì)的濃度（摩爾/升）
指數(shù)p、q、r分別表示丙酮、溴、氫離子的反應(yīng)級(jí)數(shù)
在其它試劑沒(méi)有明顯吸收的波長(zhǎng)下，用分光光法在400nm處直接觀察Br2濃度的減小，就很 容易跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。對(duì)于固定的吸收池的厚度，吸光度A就與Br2的濃度呈正比，令比例系數(shù)為B，則存在下式：
A=BC
通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，便可得出反應(yīng)速度k及反應(yīng)級(jí)數(shù)來(lái)，實(shí)驗(yàn)證明對(duì)Br2是零級(jí)，即q等于 零。若測(cè)出兩個(gè)或兩個(gè)以上溫度的速度常數(shù)（k1、k2），則可根據(jù)阿侖尼烏斯公式計(jì)算出反應(yīng)活化能來(lái)。
Log k2/k1 =E0（T2/T1）/2.30 RT1T2
式中：k1、k2分別為溫度T1、T2下的反應(yīng)速度常數(shù)
R為氣體常數(shù)，8.314焦耳/開(kāi)爾文·摩爾
E0為活化能
4.9 在有機(jī)分析中的應(yīng)用
有機(jī)分析是一門(mén)研究有機(jī)化合物的分離、鑒別及組成結(jié)構(gòu)測(cè)定的科學(xué)，它是在有機(jī)化學(xué)和分析化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的綜合性學(xué)科。在國(guó)民經(jīng)濟(jì)的許多領(lǐng)域都用有機(jī)分析。［3］
波長(zhǎng)在190-800nm的電磁光譜對(duì)于判斷有機(jī)分子中是否存在共軛體系、芳環(huán)結(jié)構(gòu)及C=C、C=O 、N=N之類的發(fā)色團(tuán)是一個(gè)很好的手段。具有鵂繾蛹骯查釧幕銜鐫謐賢馇星烈的吸收，其摩爾吸光系數(shù)可達(dá)104-105（而紅外吸收光譜的摩爾吸光系數(shù)一般均小于10 3），因而檢測(cè)靈敏度很高。對(duì)于一些特列類型的結(jié)構(gòu)，可通過(guò)簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)運(yùn)算確定zui大吸 收。如果發(fā)色團(tuán)之間不以共軛鍵相連的話，其紫外吸收具有可加性，即總的吸收等于各單獨(dú)發(fā)色團(tuán)的吸收之和。用此性質(zhì)曾成功地推導(dǎo)出利血平及氯霉素的部分結(jié)構(gòu)。一個(gè)復(fù)雜分子的結(jié)構(gòu)，往往可以由比較化合物的紫外光譜性質(zhì)而推斷其含有何種發(fā)色團(tuán)，有時(shí)還能提供一些立體結(jié)構(gòu)及分子量的一些信息，為未知物的剖析提供有用的線索。以下通過(guò)一些實(shí)例說(shuō)明分光光度法在有機(jī)分析中的應(yīng)用。
例11 氯霉素分子中的硝基首先是由它的紫外光譜而確定的，在紫外光譜中298nm和278nm處 出現(xiàn)芳香硝基的特征吸收。
五圓環(huán)酮和羧酸酯的紅外特征吸收都在1740cm-1附近，難以區(qū)別。但在紫外光譜中只有前者在210nm以上有吸收，從而得以區(qū)別。
例12 利用紫外分光光度法進(jìn)行定量分析時(shí)，可將待測(cè)試樣的純品配制成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 ，事先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由待測(cè)未知樣品吸光度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可得到其含量。當(dāng)未知物樣品為幾種組分，且這組分的雖ax互不重疊，則可用聯(lián)立方程解之。如復(fù)方阿司匹林（ A.P.C）含有三種組分：阿司匹林（A）、非那西?。≒）、咖啡因（C），阿司匹林和咖啡因的zui大吸收在277nm和275nm，較為接近，必須事先分離，而咖啡因和非那西丁的zui大吸收相距較 遠(yuǎn)，可用聯(lián)立方程解之。將待分析的藥片粉碎并溶于氯仿中，用4% 的碳酸鈉水溶液萃取兩次，用蒸餾水洗滌一次，合并水層。則阿司匹林進(jìn)入水層，非那西丁和咖啡困留在氯仿中。再用氯仿洗滌水層三次，進(jìn)一步提取水層中殘留的非那西丁和咖啡因。合并氯仿層，并過(guò)濾到250mL容量瓶中，用氯仿稀釋至刻度。zui后移取1mL此液到100mL容量瓶中，用氯仿稀釋至 刻度。取此液在250nm和275nm處測(cè)定吸光度。分別測(cè)得為0.795和0.280。水層用稀酸酸化（p H為2），用氯仿萃取后，將萃取液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，以氯仿稀釋至刻度，在277nm處測(cè)其吸 光度為0.78。通過(guò)配制的已知濃度的樣品可求出100mg/L的阿司匹林在277nm處的吸光度為0. 72，可知待測(cè)樣品中的阿司匹林的含量為100×0.78/0.72=108mg/L，也就是10.8mg/100mL， 即藥片含阿司匹林10.8g。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的非那西丁溶液，測(cè)得其比吸光系數(shù)為k250=0.0767 　L/mg.cm,k275=0.0200L/mg.cm對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的咖啡因溶液，測(cè)得其比吸光系數(shù)為k250 =0.0177L/mg.cm,k275=0.0518L/mg.cm由此可列出聯(lián)立方程，解得咖啡因濃度為1 .55mg/L，即0.155mg/100mL非那西丁濃度為10.1mg/L,即1.01mg/mL，由于未知溶液稀釋了250倍，所以藥片中含非那西丁的量為1.01×250=252mg，含咖啡因的量為0.155×2 50=38.8mg。
同樣，甲苯酚中的甲基和羥基因位置不同有鄰、間、對(duì)三種異構(gòu)體，它們有各自不同的吸收譜帶，可分別在波長(zhǎng)277、273、268nm處測(cè)定光度，解聯(lián)立方程即可算出混的中各自組分的含量。
例13 通過(guò)對(duì)兩個(gè)有機(jī)化合物（以環(huán)已烷為溶劑）的紫外光譜比較，發(fā)現(xiàn)（Ⅱ）的紫外光譜中26 0nm處的吸收峰與（Ⅰ）的相比大為減弱，從而表明空間位阻效應(yīng)的存在。這是由于有機(jī)化合物（Ⅱ）中分子中心單鍵的鄰位上有了兩個(gè)體積較大的取代基（甲氧基），使兩個(gè)苯環(huán)以中心鍵 為軸，發(fā)生扭曲而不能處于同一個(gè)平面內(nèi)，此時(shí)共軛關(guān)系受到很大影響，故使反應(yīng)苯環(huán)下鍵為特征的260nm處的吸收就大大減弱了。
例14 在有機(jī)化合物（Ⅲ）中，由于兩個(gè)苯環(huán)上相互處于鄰位的四個(gè)甲基的位阻效應(yīng)，使得兩個(gè)苯環(huán)不能處于同一個(gè)平面內(nèi)，其間的共軛關(guān)系被破壞。反映在其紫外光譜上，此化合物的紫外光譜很近似地等于兩個(gè)孤 立的間*苯? ? 光譜之和， 而與二聯(lián)苯? 的吸收光譜無(wú)關(guān)。
例15 制備衍生物也是擴(kuò)大紫外光譜應(yīng)用范圍的一個(gè)途徑。我們可以利用紫外光譜測(cè)定有機(jī) 物胺類化合物（RNH2）的分子量。RNH2本身在紫外區(qū)是沒(méi)有吸收的，但可以利用化學(xué)反應(yīng)制備 衍生物，引入一個(gè)新的共軛系統(tǒng)。
反應(yīng)產(chǎn)生的胺苦味酸鹽（1+1加成產(chǎn)物）在紫外有吸收。當(dāng)波長(zhǎng)為380nm時(shí)，大多數(shù)的胺苦味酸鹽在95%乙醇中的摩爾吸光度系數(shù)大致相同，均在1.344×104，因此我們 就可以從苦味酸鹽的乙醇溶液在380nm處的吸收，由公式計(jì)算出胺苦味酸鹽的分子量，進(jìn)而再折成未知胺的分子量。
例如，用此方法測(cè)定古柯堿的分子量，將古柯堿苦味酸鹽2.159mg溶于100mL95%乙醇溶液中，在1厘米厚吸收池中測(cè)得其吸光度為0.550，又知苦味酸的分子量為229，這樣就可 以計(jì)算出古柯堿的分子量為
M=13440×2.519×10/（1000×0.550）-229=299
按古柯堿分子式（C11H21O4N）計(jì)算的話，其分子量應(yīng)為303，與此法計(jì)算出的分子量的偏差僅為-0.8%。
用此方法測(cè)定各類化合物的衍生物及分子量的有關(guān)數(shù)據(jù)如表1所示。
表1 分光光度法測(cè)各類化合物分子量的數(shù)據(jù)
化合物衍生物雖ax（nm）Emax
胺苦味酸鹽38013440
飽和醇-2,4*丙酸酯24214440
醛和酮2，4*腙36022000
糖脎39720360
乙醇分子中不存在共軛系統(tǒng)，它在波長(zhǎng)200-800nm范圍內(nèi)是沒(méi)有吸收的，當(dāng)乙醇與異氰酸苯酯（Ar-N=C=O）反應(yīng)后，在波長(zhǎng)280nm處就會(huì)出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收。
例16 有時(shí)很強(qiáng)的吸收會(huì)引起干擾作用，象有些稠環(huán)化合物對(duì)某些波長(zhǎng)的吸收就很強(qiáng)，也可 以采用化學(xué)鴟從θコＨ纈謝銜鏍煬哂腥齟箴鍵，在波長(zhǎng)252nm處有很強(qiáng)的吸收，其摩爾吸光系數(shù)可達(dá)2×105會(huì)對(duì)一些在此也有吸收的化合物產(chǎn)生干擾，我們可以讓 它與丁烯二酸酐發(fā)生狄爾斯-阿爾德（Diels-Alder）加成反應(yīng)：
這樣一來(lái)，原來(lái)三個(gè)大鵂查釹低塵捅黃蘋(píng)盜?，原先很强的吸收就被大大架V趿恕£
結(jié)語(yǔ) 所述紫外可見(jiàn)分光光度法具有儀器價(jià)格低廉適用性廣泛，尤其是采用微機(jī)控制以來(lái)，該技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。近年來(lái)我國(guó)儀器制造廠可以生產(chǎn)出與國(guó)外等同水平的紫外分光光度計(jì)，成為分析者的*選擇。